作为神经系统信息交流的“通货”，神经电活动是大脑处理复杂信息的物理基础。与膜片钳和微电极阵列记录等基于电极材料的传统电生理技术相比，荧光膜电位成像在时空分辨率、测量通量等方面具有明显的优势。其中，发射波长在远红区（640 nm以上）的荧光探针由于其红移的光谱具有更强组织穿透能力，而且可适于多通路成像观测，因而备受研究人员青睐。然而目前可使用的远红区膜电位探针在亮度和灵敏度方面存在严重缺陷，因此亟需发展适用于记录神经元动作电位的高性能荧光探针。
2021年4月15日，生命中心、北京大学化学与分子工程学院邹鹏课题组与陈鹏课题组共同在Nature Chemistry杂志在线发表了他们最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”，他们综合利用生物正交反应和膜蛋白工程化改造策略，开发出一系列具有高灵敏度和成像信噪比的荧光膜电位探针HVI（hybrid voltage indicator）。根据成像光谱需求，HVI的蛋白质骨架可借助生物正交反应搭配不同的荧光染料结构，构建出一系列跨越可见光谱的复合型探针。其中，橙红区探针HVI-Cy3具有最高的灵敏度，能够以高达90的信噪比成像记录神经动作电位；远红区探针HVI-Cy5具有最红移的光谱，不仅可与绿色或红色荧光探针同时使用，实现膜电位与钙离子、神经递质等重要生理信号的并行观测，还能够与光遗传学工具联用，实现全光学神经电生理检测。
图1 复合型膜电位探针HVI检测神经元膜电位概念图
邹鹏课题组长期致力于发展和应用化学探针技术，研究参与神经信号转导过程的生物大分子、支配神经活动的化学和物理信号。他们率先提出“复合型膜电位探针”的概念，利用化学手段将荧光染料与视紫红质蛋白相偶联，利用后者的电致变色效应实现膜电位成像（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953）。陈鹏课题组长期致力于发展适用于活细胞及活体动物的生物正交反应，并通过遗传编码技术，实现了蛋白质的特异标记、激活与调控（Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 129-137）。在最新的研究成果中，两个课题组合作，将化学反应策略与蛋白质骨架改造相结合，对神经元的膜蛋白进行了原位的“生物正交”工程优化。一方面，鉴于目前大多数生物正交反应难以高效地标记膜蛋白，以及点击化学反应（铜催化炔基-叠氮环加成反应）对神经元的毒性，他们改用了生物相容性更好、效率更高的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA），将高荧光量子产率的远红区染料引入工程改造的视紫红质蛋白的特异位点。另一方面，他们针对视紫红质蛋白Ace2中的关键质子受体氨基酸残基进行突变筛选，最终得到了消除稳态光电流且亮度及灵敏度显著提升的远红区复合型探针HVI-Cy5。当神经元膜电势发生去极化时，质子电化学势的改变促进视黄醛席夫碱的质子化，从而改变视紫红质的吸收光谱，最终通过FRET效应影响其偶联荧光染料的量子产率，导致荧光信号变化（图2）。
图2 复合型膜电位探针HVI荧光标记方法示意图及探针响应细胞膜电位变化原理图
实验表明，HVI-Cy5可与光遗传学工具联用（图3）。研究人员用短波长光单向或者双向调控神经元兴奋性，同时在远红区荧光通道记录膜电位变化，扩充了全光学电生理学工具箱（图3a-c）。该技术相比于传统的多电极膜片钳刺激并记录，技术难度明显下降。HVI-Cy5还可以与其他荧光探针进行双色成像，无串扰监测细胞膜电势及钙离子、递质和pH等生理信号（图3d-f）。多色成像将帮助研究者更好地了解膜电位与其他生理信号动态变化的联系和差异。
图3具有深红荧光光谱的HVI-Cy5可与光遗传学工具及钙探针联用实现全光学电生理检测
此外，实验将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在培养的大鼠海马体神经元中，利用膜电位成像评估APV和NBQX两种药物对神经元突触连接的影响，解析了NMDAR和AMPAR两类谷氨酸受体对突触信号传递的贡献（图4）。未来，HVI-Cy5有望在体外筛选作用于受体蛋白的激动剂或拮抗剂。
图4 将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在不同神经元中可以研究药物对神经突触的作用
总之，本文通过对视紫红质膜蛋白的“生物正交”工程优化，发展了适用于神经元电信号记录的远红区高性能荧光探针HVI-Cy5，实现多色成像和全光学电生理学应用，期待该探针能够帮助研究者解读更加复杂的神经元电生理信号。
北京大学化学与分子工程学院博士研究生刘书彰、林畅、生命中心博士毕业生胥永显（现浙江大学医学中心博士后）为该论文的共同第一作者。北京大学邹鹏研究员和陈鹏教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、生命科学联合中心、北京分子科学国家研究中心和生物有机与分子工程教育部重点实验室的资助。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-021-00641-1
